械質(zhì)的變化種子檢測技術(shù)及其進(jìn)展張?zhí)伊?/h1>

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導(dǎo)讀：近幾年來，農(nóng)業(yè)機械化發(fā)展不僅要注重產(chǎn)品質(zhì)量，隨著生化分析和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，同時也要注重作業(yè)質(zhì)量、維修質(zhì)量和服務(wù)質(zhì)量；不僅要注重農(nóng)機產(chǎn)品的一般技術(shù)指標(biāo)，農(nóng)作物種子檢驗方法已由外觀形態(tài)發(fā)展到生理生化水平和分子水平上的鑒正。

　　種子檢測技術(shù)及進(jìn)展

　　近幾年來，同時也要注重農(nóng)機產(chǎn)品的安全性、適用性和對生態(tài)環(huán)境的影響；不僅要注重農(nóng)機試驗鑒定，隨著生化分析和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，同時也要注重標(biāo)準(zhǔn)制定、質(zhì)量調(diào)查、投訴監(jiān)督等工作。 張?zhí)伊终f，農(nóng)作物種子檢驗方法已由外觀形態(tài)發(fā)展到生理生化水平和分子水平上的鑒正。

　　一、形態(tài)檢驗法

　　形態(tài)學(xué)方法是檢驗人員借助放大鏡、解剖鏡等工具，近年來，依據(jù)某一作物品種不同于其他品種的特定的外觀形態(tài)特征來進(jìn)行鑒定的方法。

　　1.種子形態(tài)檢驗法根據(jù)種子形狀、大小、色澤、質(zhì)地、表面的光與毛以及種子外表各位的特征來加以鑒別，農(nóng)業(yè)機械化事業(yè)適應(yīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)社會的深刻變化，以區(qū)分本品種與異品種。該法簡單、經(jīng)濟(jì)、快速，在中前進(jìn)，但準(zhǔn)確性較差，在創(chuàng)新中發(fā)展，且隨著現(xiàn)代育種科學(xué)的發(fā)展，探索出一條以“農(nóng)民自主、扶持，不同品種間種子外觀形態(tài)的差異越來越小，市場引導(dǎo)、社會服務(wù)，因此靠區(qū)別種子形態(tài)上的差異來鑒定種子也變得越來越困難。

　　2.種苗形態(tài)檢驗法 該法根據(jù)不同品種幼苗的獨特性狀進(jìn)行檢驗，共同利用、提高效益”為主要特征的特色農(nóng)業(yè)機械化發(fā)展道路。農(nóng)業(yè)機械化的快速發(fā)展，如幼苗芽鞘顏色、幼苗生長錐、于葉的形狀、顏色、大小等。該法簡便、時，顯著提高了農(nóng)村勞動生產(chǎn)率，但受環(huán)境的影響頗大，大大拓寬了農(nóng)民增收渠道，檢驗結(jié)果不夠可靠。

　　3.田間小區(qū)種植檢驗法(成株期形態(tài)檢驗法) 該法是將一定量的作物種子在田間種植一個小區(qū)，有效提升了農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力，單粒播種，為推動農(nóng)機工業(yè)振興，不間苗，促進(jìn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)繁榮做出了重要貢獻(xiàn)。 張?zhí)伊种赋?，不定苗，農(nóng)業(yè)機械化質(zhì)量工作事關(guān)農(nóng)業(yè)機械化發(fā)展全，并設(shè)有標(biāo)準(zhǔn)品種小區(qū)作對照，事關(guān)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展和新農(nóng)村，成株期依據(jù)其主要特征鑒定，今后一個時期更要關(guān)注農(nóng)業(yè)機械化質(zhì)的變化提高，這是最為通用的且比較可靠的方法。主要根據(jù)株形、株高、葉片數(shù)、葉色、葉片寬窄、花藥顏色等作出評判。但此法所需時間較長，這是農(nóng)機化發(fā)展的主要趨勢，當(dāng)年所生產(chǎn)的種子要等下一個生長季節(jié)或異地鑒定才能得到結(jié)果，往往喪失商機，且費工占地。而且這種方法受環(huán)境影響頗大，使得鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定程度的影響。由于形態(tài)學(xué)方法的諸多不足，用一種快速、簡便、準(zhǔn)確、實用的室內(nèi)檢測方法來代替形態(tài)法已成必然。將電泳技術(shù)和DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到鑒定這一領(lǐng)域，恰恰順應(yīng)了這一要求。

　　二、蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢驗法

　　蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢驗法是指利用電泳技術(shù)對備檢樣品的種子或幼苗的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、染色，形成蛋白質(zhì)電泳譜帶的差異，并與標(biāo)準(zhǔn)品種相比較，從而鑒定品種的真實性和的一種方法。不同作物品種，基因不同，基因的直接表達(dá)產(chǎn)物――蛋白質(zhì)在種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)等方面亦不同。該法即是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性來反映不同品種DNA 組成上的差異，從而進(jìn)行品種鑒定。該法快速、可靠，不受環(huán)境影響。

　　1.同工酶電泳法同工酶是指來源相同，催化相同反應(yīng)而結(jié)構(gòu)不同的酶分子類型，具組織、發(fā)育和品種間特異性。該法是指利用電泳技術(shù)(包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳等) 來分離各種酶的同工酶，通過比較同工酶諾，來確定作物種子的。目前，在作物種子鑒定中，最常用的、多態(tài)性較強的是脂酶和過氧化物酶，所用方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳法。Quillet等(1992)研究了地理起源不同的52個向日葵自交系的8個同工酶系統(tǒng)，表明同時運用8種同工酶系統(tǒng)可鑒定出其中45個基因型，占總基因型的84%。但與其他方法相比，該法還存在著一些不足：①同工酶具組織、發(fā)育的特異性：不同組織、不同發(fā)育時期，同工酶的數(shù)量和組成不同。利用同工酶鑒定種子所用材料多為幼苗，而將種子萌發(fā)為幼苗不光費時，還往往因為種子在萌發(fā)進(jìn)程上的不一致而導(dǎo)致檢驗結(jié)果偏差較大； ⑦譜帶位點與凝膠濃度、提取液、電泳程序等有關(guān)；②因酶易失活，故技術(shù)上有一定難度。

　　2.種子貯藏蛋白電泳法種子中所含的貯藏蛋白質(zhì)可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。每一類蛋白質(zhì)的比例因物種而異，但在品種鑒定上多是根據(jù)醇溶蛋白(禾谷類)和球蛋白 (豆類)的多樣性。不同蛋白質(zhì)所帶電荷不同，在電場中泳動的速度也不同，電泳之后，通過染色顯示蛋白質(zhì)條帶的數(shù)目、位置和顏色深淺，便構(gòu)成品種的“指紋” 特征，可用于品種鑒定。所用電泳技術(shù)包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳及等電聚焦電泳等。 E11Zs等(1997)利用淀粉凝膠電泳分析了29個英國小麥品種的醇溶蛋白，除極個別外，這些品種都能被區(qū)分開。但值得注意的是，對于某些遺傳組成非常接近的品種，如保持系和不育系，不易找到特異蛋白，采用蛋白質(zhì)電泳難以發(fā)現(xiàn)特征帶。另外，蛋白質(zhì)電泳圖譜易受種子 (或幼苗)發(fā)育階段及表達(dá)器官的影響，有時不夠穩(wěn)定，影響了圖譜分析，從而影響了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　目前，國外許多先進(jìn)種子檢驗實驗室多采用超薄等電聚焦電泳法來進(jìn)行品種鑒定。該法操作方便、準(zhǔn)確性高、制膠速度快。由于凝膠超薄(0.15mm)，因而可降低檢驗成本，且縮短了固定、染色和脫色時間。再加上該法采用水平平板電泳槽，可進(jìn)行雙聚焦，這樣就大大增加了點樣數(shù)量，從而提高了工作效率。

三、DNA分子標(biāo)記技術(shù)檢驗法

　　品種間形態(tài)和生化上的區(qū)別.歸根到底是 1DR種間在基因(DNA)上的區(qū)別。DNA分子標(biāo)記技術(shù)即是通過對品種DNA的多態(tài)性即DNA 減基序列的差異進(jìn)行分析，從而鑒別不同品種。其檢測對象是種子的DNA片段(基因)，沒有器官的特異性，不受環(huán)境的影響，有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。目前，在作物品種鑒定中應(yīng)用的有RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、微衛(wèi)星技術(shù)和AFLP技術(shù)等。

　　1.RFLP技術(shù) RFLP(Restriction Frag― nent Len Polymorphism)是由GrOdztcker 〔1974)最早創(chuàng)立的，是分析不同生物個體間基因細(xì)微差異的可靠方法。它的基本原理是：當(dāng)用限制性內(nèi)切酶切割不同品種的DNA時，會產(chǎn)生相當(dāng)多的數(shù)目和大小不等的DNA片段。對其進(jìn)行電泳，并利用放射性同位素標(biāo)記的 DNA作探針進(jìn)行分子雜交，來顯示與探針同源的酶切片段在長度上的多態(tài)性，從而將不同 1bn種的種子區(qū)別開來。由于同種作物不同品種間能找到較多RFLP標(biāo)記，利用某一品種特定的RFLP可以準(zhǔn)確地標(biāo)記該品種，因而該項技術(shù)是進(jìn)行品種真實性及鑒定的可靠方法。 RFLP多態(tài)性穩(wěn)定、容易重復(fù)，結(jié)果準(zhǔn)確。但該技術(shù)也存在一些不足之處：多態(tài)有限、成本昂貴、費時，同時放射性同位素的使用會影響人體安全，從而限制了該技術(shù)在實踐中的應(yīng)用。

　　2.RAPD技術(shù) RAPD(Randomly AmPli― ied Polymorphic DNA)是由美國杜邦公司 Williams等人(1990)和加利福尼亞生物研究所 Welsh等(1990)領(lǐng)導(dǎo)的兩個小組同時發(fā)展起來的一種新的DNA指紋技術(shù)。此技術(shù)利用隨機合成的寡聚核昔酸序列(9～10個bp)作為引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，并經(jīng)溴化乙錠染色或銀染色得到多態(tài)性的DNA圖譜。在基因組上，每個引物可以連續(xù)直接擴(kuò)增特定的DNA 片段，對一個特定的基因型來講，這些擴(kuò)增的片段或片段的類型是唯一的，因此用來鑒定品種是很有用的。傅家瑞(1994)曾報道：從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術(shù)擴(kuò)增DNA片段；科學(xué)院遺傳所陳洪等(1996)利用OPP―18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優(yōu) 63雜種，鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定完全一致。 RAPD技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強，操作簡便，速度快，費用低，既有大量的隨機引物可供篩選之用，又不受種屬的限制，被廣泛用于多種作物的種子鑒定。 RAPD技術(shù)不足之處： ①提供的信息不夠全；②結(jié)果重復(fù)性不好； ⑤RAPD一般為顯性標(biāo)記，不能鑒定雜合子； ④提取種子DNA的方法仍較繁瑣。因此，該項技術(shù)在種子鑒定中存在有一定的限性。

　　3.微衛(wèi)星技術(shù)真核生物的基因組中散布大量的串聯(lián)重復(fù)序列，其中，2～4個bp的微衛(wèi)星序列(Micmsatellite或叫簡單序列重復(fù) SSR：Simple5equenceRepeats)具有高度多態(tài)性(Taubll989，Tautz和Eenz，1984)，為DNA 指紋分析提供了基礎(chǔ)c 微衛(wèi)星在結(jié)構(gòu)上的最大特點是兩端序列較保守，因此可設(shè)計與兩端保守序列互補的引物進(jìn)行PCE擴(kuò)增，來揭示微衛(wèi)星的多態(tài)性，從而減少了酶切、制備探針、分子雜交等繁瑣程序。RusBell等(1997)發(fā)現(xiàn)在11個大麥SSR 中，利用4個SSR組成的3個不同組合均可以區(qū)分24個大麥品種，錯誤概率僅為千分之一，來自相同親本的不同基因型也可區(qū)分開。與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法和其他品種鑒定技術(shù)相Lb，該技術(shù)多態(tài)性水平高(可用于亞種間鑒定，已在水稻的品種鑒定中得到應(yīng)用)，易于分析，不受環(huán)境影響。但該技術(shù)程序復(fù)雜，費用較高，盡管在種子檢驗上具有潛力，但目前尚不能普及。

　　4.AFLP AFLP(Amplified Fragnent Len― gyh Po1ymorphism)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性是荷蘭科學(xué)家Zabean等人(1993)發(fā)明的一項專利技術(shù)，實質(zhì)是RFLP和PCR兩項技術(shù)的結(jié)合，具有RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的高效性。其原理如下：當(dāng)基因組ONA經(jīng)酶切后，會形成大小不等的隨機限制性DNA片段，在這些限制性片段的兩端連接上與酶切位點配對的特定接頭，然后用與接頭互補的專用引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增、電泳、放射自顯影顯示DNA指紋。為有選擇地擴(kuò)增某些限制性片段，專用引物在酶切位點序列的3’端還添加1―10個長度不等的隨機脫氧核苷酸，由此可調(diào)節(jié)AFLP 產(chǎn)物條帶的特異性和數(shù)量。該技術(shù)避免了分子雜交的復(fù)雜程序，靈敏度高、快速、多態(tài)性強、DNA的用量少、具較好的重復(fù)性。不足之處是操作時間長，步驟多，對實驗技能及儀器設(shè)備的精密度要求很高，加之是專利技術(shù)，受專利法保護(hù)，所以該法不宜大面積普及推廣。綜上所述，作物種子檢驗技術(shù)已由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法發(fā)展到分子水平，其方法是由簡單到復(fù)雜，結(jié)果也更加精確。每一種方法都有其自身的優(yōu)缺點，至今還沒有哪一種方法能夠比較準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行種子檢驗。與其他方法相比，DNA分子標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性豐富、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、無器官發(fā)育時期的特異性，不受環(huán)境影響，但所需儀器精密、藥品昂貴，程序復(fù)雜，離普及和應(yīng)用尚有距離。因此，在進(jìn)行具體的種子檢測時，應(yīng)視具體情況靈活掌握，將傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法、現(xiàn)代生化方法和分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，充分發(fā)揮綜合技術(shù)優(yōu)勢，方能達(dá)到準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、 快速檢測的目的。

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